傷口愈合實驗--TARBP2的類泛素化（SUMOylated）調(diào)節(jié)miRNA/siRNA作用

小RNA介導(dǎo)的基因沉默對于基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄前調(diào)節(jié)尤其重要，但是，如何調(diào)節(jié)miRNA/siRNA的作用機理還并未研究清楚。上海交大醫(yī)學(xué)院的科研人員在2015年的NATURE COMMUNICATION上發(fā)的文章中研究調(diào)節(jié)miRNA/siRNA發(fā)揮作用的因子。研究表明，TARBP2的類泛素化（SUMOylated）不會對成熟的的miRNA的產(chǎn)物有左右，但是會影響miRNA/siRNA的效用。其會引入Ago2來形成RNA沉默聚合體，并且會介導(dǎo)表達(dá)更多的miRNA前體結(jié)合到這一復(fù)合體上，從而進(jìn)一步介導(dǎo)RNAi。

傷口愈合實驗是體外研究細(xì)胞遷移的一個有用的實驗。原理是人為的在鋪板的單層細(xì)胞中制造一個空白的無細(xì)胞的地帶，然后對這個無細(xì)胞地帶的邊緣的細(xì)胞進(jìn)行觀察；這些邊緣的細(xì)胞會開始進(jìn)行遷移活動，并且終覆蓋整個無細(xì)胞的區(qū)域，重新互相接觸在一起。本研究中用到傷口愈合的實驗，使用TARBP2和pri-miR130b共表達(dá)，通過對傷口愈合的速度的影響，得出TARBP2-K52R可以抑制pri-miR130b對傷口愈合過程的影響。

SUMOylation of TARBP2 regulates miRNA/siRNA efficiency.
Chen C, Zhu C, Huang J, Zhao X, Deng R, Zhang H, Dou J, Chen Q, Xu M, Yuan H, Wang Y, Yu J. 
Nat Commun. 2015 Nov 19;6:8899. doi: 10.1038/ncomms9899

在文中，使用Ibidi開發(fā)的傷口愈合插件進(jìn)行了傷口愈合實驗。這是一種雙孔的硅膠插件，可以放在培養(yǎng)皿中，插件兩孔間的孔壁寬度為500μm。將細(xì)胞種在插件中，等待細(xì)胞貼壁長滿后，將插件移除，這樣，兩孔間的縫隙就是一個無細(xì)胞的“劃痕”。

（一）實驗材料
1)細(xì)胞:    serum starved A549luc stable cell line 
2)實驗耗材:   傷口愈合插件培養(yǎng)皿 (ibidi, 81176) 
3)細(xì)胞培養(yǎng)基:  DMEM   （Hyclone） 
4)試劑:  Lipofectamine 2000 （Invitrogen）
5)滅菌鑷子

（二）實驗步驟
1）鋪細(xì)胞（圖三）
?將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除。
?在ibidi細(xì)胞插件的每孔中加入5 × 103的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動培養(yǎng)皿。以防止細(xì)胞不均勻。
?在37。C培養(yǎng)箱中孵育24小時。

圖三：A. 去除培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞。

2）形成“劃痕”
?采用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞4小時
?如圖四所示，小心的用鑷子夾住插件的一個角，將插件移除。 
           
?移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”。
?小心的清洗細(xì)胞，之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（圖五）。

3）采集并分析圖像
?在顯微鏡下選取能同時看到“劃痕”和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像，“劃痕”的方向好是水平或者垂直。
?采集0h和10h的圖像，并且分析每張圖的細(xì)胞覆蓋劃痕區(qū)的面積。

（三）實驗結(jié)果

如圖所示，共表達(dá)pri-miR130b和TARBP2-WT（miR130b-WT）比單獨表達(dá)pri-miR130b（miR130b-con）對細(xì)胞遷移更有抑制作用，而將pri-miR130b和TARBP2-K52R（miR130b-K52R）共表達(dá)對于細(xì)胞遷移基本沒有抑制作用了。