導(dǎo)言

近幾年來，3D（three dimensional）細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)開始成為生物學(xué)研究新的研究方法。使用3D系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)能更好的模擬生物體內(nèi)的真實生理環(huán)境，而2D（傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)）細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)不能有效的模擬細(xì)胞在生物體內(nèi)的生理環(huán)境。3D細(xì)胞技術(shù)有很多種方法，使用多細(xì)胞形成的細(xì)胞團是其中主要的研究應(yīng)用之一。細(xì)胞團是微小的細(xì)胞聚集簇，可以用來研究3D情況下向外生長的情況（細(xì)胞出芽）。

一.實驗原理

目前有幾種方法可以用來生成細(xì)胞團。 所有方法的原理都是防止細(xì)胞貼壁，并且創(chuàng)造環(huán)境增強臨近細(xì)胞間的細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。這里我們提供的是一個液體膠的形式來形成細(xì)胞團。這是一種形成細(xì)胞團的非常簡單的方法，有如下的優(yōu)勢：

1）可以形成單個細(xì)胞團，并且易于用顯微鏡觀測；

2）易于換液，可以進(jìn)行長時間的培養(yǎng)；

3）這個方法操作簡單，不需要額外的設(shè)備就能完成。

簡單來講就是先在多孔板底部加入瓊脂糖，之后再加入細(xì)胞懸液。加入瓊脂糖不僅僅是提供了個疏水表面，細(xì)胞不會粘附，又提供了一個凹液面，細(xì)胞可以聚集在凹孔中，加大了細(xì)胞和細(xì)胞之間接觸的幾率，增強了細(xì)胞之間的粘附。

二.實驗材料

96孔板，平底（Corning 3370）

血管生成載玻片（德國ibidi，81506）

1.5%瓊脂糖（Sigma，A9539，使用PBS或者超純水配置）

胰酶

Matrigel

細(xì)胞培養(yǎng)基

三.成團實驗步驟

1）96孔板預(yù)處理

• 配置1.5%瓊脂糖，保持配好的瓊脂糖為液體狀態(tài)
• 96孔板每孔添加50μl配置好的1.5%瓊脂糖，室溫靜置20分鐘，待瓊脂糖冷卻固化。50μl瓊脂糖能剛好覆蓋96孔板單孔的底部，并且形成凹液面。
• 在96孔板的孔間加入無菌PBS，保證實驗的濕度

2.細(xì)胞成團

• 按照日常方法準(zhǔn)備細(xì)胞懸液
• 根據(jù)試驗設(shè)計確定單孔需加入的細(xì)胞個數(shù)，本例中，每孔加入500個細(xì)胞
• 加入50-100μl的稀釋好的細(xì)胞懸液，保證每孔總液體體積（包括瓊脂糖）不超過200μl，每孔細(xì)胞數(shù)500個
• 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
• 每天都要換液，注意在細(xì)胞成團過程中不能劇烈晃動培養(yǎng)板
• 可以用相差顯微鏡觀察細(xì)胞成團情況（圖一）。

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                  圖一：不同細(xì)胞系的成團過程（每孔500個細(xì)胞），比例尺 200μm。

四.出芽實驗及分析

實驗步驟：

1. 準(zhǔn)備基質(zhì)膠

• 實驗前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過第二天緩慢融化。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4。C預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）
• 開始實驗前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。
• 打開滅菌包裝，取出ibidi血光生成載玻片 µ-Slide Angiogenesis。
• 每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

2.凝膠 

• 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
• 準(zhǔn)備一個10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個濕盒。
• 將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
• 將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。

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3.細(xì)胞出芽實驗及圖像分析

• 將形成的細(xì)胞團吸出，置于凝固的膠平面上
• 培養(yǎng)并使用顯微鏡采集出芽圖像
• 采用圖像分析軟件采集細(xì)胞團面積，出芽覆蓋面積，出芽個數(shù)以及總出芽長度等數(shù)據(jù)。